圖11I顯示在第2、4及10週齡以小鼠設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的mRNA含量。 為了評估在PAHenu2小鼠中靶基因座整合的數量和保真度，進行兩個方法以檢測整合事件：ddPCR及次世代定序。 為了判定靶基因插入在整合位點是否伴隨新生突變，對橫跨左及右同源臂且進入靶插入位點的基因體序列的PCR擴增子進行定序。 分子療法 分子療法 評估了橫跨每個同源臂的插入特異性擴增子（hPAH依賴的PCR）或橫跨每個同源臂的WT／未插入等位基因（沒有hPAH插入）。 在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種質體內。
藉由施用PAH替代物（例如苯丙胺酸脫氨酵素）之酶置換，可導致免疫反應進而減低療效及/或引起副作用。 至於遺傳修飾益生菌療法，表達PAL之大腸桿菌的致病性已經是一個問題。 從出生開始用低含量之苯丙胺酸配方的飲食管理大幅度地防止病症之神經性後果的發展。 然而，即使是低蛋白飲食，兒童仍患有發育遲緩，而成人時常患有骨質疏鬆症及缺乏維他命。
亦提供使用AAV組成物之方法，及用於製備AAV組成物之封裝系統。 如請求項1至34中任一項之rAAV，其中該5’同源臂核苷酸序列與該第一基因體區域至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。 圖 13A 及 13B顯示為封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3分別對每ug基因體DNA所檢測到之載體基因體含量及自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中每10 ng總RNA所檢測到的mRNA表達含量的影響的圖。 圖 13C顯示為，依所指定劑量給予封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3後於不同時間點自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中所檢測到靶上插入頻率的圖。
如本文所用，術語「整合」係指藉由rAAV基因體及靶基因座之間的同源重組將編輯元件引入靶基因座中（例如PAH基因）。 分子療法 整合編輯元件可導致在靶基因座（例如PAH基因）中置換、插入及/或缺失一或多種核苷酸。 如本文所用，術語「靶基因座」係指經編輯元件修飾之染色體區域或核苷酸間鍵合（例如人類PAH基因區域或核苷酸間鍵合）。 如請求項41至54中任一項之rAAV，其中該轉移基因組進一步包含該基因組的5’之5’反向末端重複（5′ ITR）核苷酸序列，及該基因組的3’之3’反向末端重複（3′ ITR）核苷酸序列。
TRE之啟動子及增強子元件可相對於編碼序列呈任何方向及/或距離，只要獲得所要轉錄活性即可。 如請求項74或75之封裝系統，其進一步包含第四核苷酸序列，該第四核苷酸序列包含一或多種輔助病毒基因。 如請求項74之封裝系統，其中該封裝系統包含有包含該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列之第一載體，及包含該第三核苷酸序列之第二載體。 如請求項41至49中任一項之rAAV，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3’之聚腺苷酸化序列。 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含該基因組的5’之5’反向末端重複（5′ ITR）核苷酸序列，及該基因組的3’之3’反向末端重複（3′ ITR）核苷酸序列。 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3’之填充序列。
如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。 通常，基因表現置於包含一或多個啟動子及/或增強子元件之TRE的控制下。 若編碼序列之轉錄受TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。
如請求項1至8中任一項之rAAV，其中該轉錄調控元件能夠介導在肝細胞、腎細胞或在腦、腦下垂體、腎上腺、胰腺、膀胱、膽囊、結腸、小腸或乳房中的細胞之轉錄。 圖 6顯示為施用PAH-032h後在FRG®小鼠的靶上插入（藉由物種特異性ddPCR編輯測定法測量）的圖。 本文中所引用之所有參考文獻（例如公開案或專利或專利申請案）均以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻（例如公開案或專利或專利申請案）具體地且個別地指示為出於所有目的而以全文引用之方式併入一般。 FRG®人類肝臟異種移植模型為免疫功能不全的小鼠品系，其含有Fah-/-、IL2rg-/-及Rag2-/-三種基因剔除。 由於IL2rg-/-及Rag2-/-剔除之這些小鼠缺乏B細胞、T細胞及NK細胞，導致人體細胞植入的可接受性。
圖3A顯示對照組小鼠（WT/Het）及ARSA（-/-）小鼠中，在四週時MAL轉錄物之含量。 對照組為野生型動物（ARSA（+/+））與雜合動物（ARSA（+/-））之混合。 藉由Trizol提取，接著進行Qiagen RNEasy管柱純化來製備小鼠總RNA。 RNA用作使用ThermoFisher High Capacity cDNA套組進行之cDNA合成之模板以產生轉錄物。 使用液滴式數位PCR及對小鼠髓鞘及淋巴細胞蛋白質（MAL）具有特異性之引子/探針集合評估MAL轉錄物，其中針對小鼠HPRT1標準化複本數。 如所顯示，在四週時，與雜合小鼠相比，ARSA（-/-）小鼠中之MAL轉錄物之含量降低。
在某些具體實施例中，功能上等效的SUMF1多肽進一步包含至少一種未在野生型SUMF1多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。 在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼包含ARSA蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。 在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼野生型ARSA蛋白質（例如人類ARSA蛋白質）之胺基酸序列。 在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼突變型ARSA蛋白質（例如人類ARSA蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型ARSA多肽為野生型ARSA多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型ARSA多肽。 在某些具體實施例中，功能上等效的ARSA多肽進一步包含至少一種未在野生型ARSA多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。 如本文中所使用，「外源聚腺苷酸化序列」係指與ARSA基因（例如人類ARSA基因）之內源聚腺苷酸化序列不一致或實質上一致之聚腺苷酸化序列。
Fah-/-基因型使這些小鼠依賴於肝臟保護藥物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮，這樣在4-8週內其撤回會導致肝細胞喪失和動物死亡。 在某些實施例中，核苷酸長度的不對稱性是由5’及3’同源臂在長度上高達90%的差異所定義的，例如長度差異高達80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%。 在某些實施例中，5’同源臂具有約50至約4000核苷酸的長度（例如約100至約3000、約200至約2000、約500至約1000核苷酸）。
- 此類轉移基因組可在感染之後及複製之前形成AAV之自互補、雙股DNA基因組。
- 組別1-4、8-11及15的血清Phe和Tyr含量隨時間推移而檢測（圖11A-11D）。
- 在某些實施例中，3’同源臂與第二基因體區域具有100%之核苷酸序列一致性。
- 此基因中之突變與高歇氏病（Gaucher disease）及異染性白質失養症相關。
- 在某些實施例中，5’同源臂與第一基因體區域具有100%之核苷酸序列一致性。
- 在某些實施例中，rAAV基因體自5’至3’包含：TRE、內含子及至少一部分PAH編碼序列。
如請求項1之方法，其中該細胞為選自由以下組成之群組之細胞：運動神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠細胞、中樞神經系統中之大腦皮質之細胞、周邊神經系統之感覺神經元、許旺細胞（Schwann cell）及其任何組合。 圖 4為顯示ARSA（-/-）小鼠之大腦中的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目與以每奈克cDNA計的hARSA之複本之數目之間的相關性之作圖。 在給藥後第28及29天處死接受單次靜脈內劑量之4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15中之pHMI-5005之NHP（第2組動物）。 在經處死之第2組動物之中樞神經系統（CNS）及腦脊髓液（CSF）中偵測人類ARSA酶活性水準（圖17）。
未處理之人類DNA與作為負控制組之PAH-032h載體混合。 在一個態樣中，本文提供新穎rAAV組成物，其用於在具有降低的或以其他缺乏PAH基因功能之細胞中恢复PAH表達。 這種rAAV組成物有效地編輯在個體中的細胞（例如肝細胞）基因體，以在肝臟特定啟動子的控制下表現PAH，而不需要通過外源性核酸酶（例如巨核酸酶、鋅指核酸酶、類轉錄活化因子核酸酶、或RNA引導的核酸酶如Cas9）的作用在靶基因座的基因體裂解來促進這種編輯。 因此，在某些實施例中，本文揭露的rAAV組成物不包含或不需要外源性核酸酶或編碼外源性核酸酶的核苷酸序列。 在某些具體實施例中，轉移基因組自5’至3’包含：5′ ITR；內部元件，其自5’至3’包含：TRE、視情況選用之非編碼外顯子及內含子、ARSA編碼序列及聚腺苷酸化序列，如本文中所揭示；不可解析的ITR；與內部元件互補之核苷酸序列；及3′ ITR。 此類轉移基因組可在感染之後及複製之前形成AAV之自互補、雙股DNA基因組。
在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包含了包含有一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。 在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包含第三載體，例如輔助病毒載體，其包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。 第三載體可為獨立第三載體、與第一載體整合在一起或與第二載體整合在一起。 另外又或者，在某些實施例中，PAH基因座可使用結合至靶基因座側翼PAH基因區域之引子經由PCR或使用結合rAAV基因體中一區域（例如包含對於靶基因座非原生之外源性序列的區域）之引子經由LAM-PCR從轉導細胞群體提取之DNA擴增而來。 由此產生的PCR擴增子可使用單分子次世代定序技術個別地定序，以判定呈現於轉導細胞群體中的所編輯的及未編輯的PAH等位基因之相對數目。 分子療法 如本文所用，術語「轉錄調控元件」或「TRE」係指順式作用核苷酸序列，例如DNA序列，其調控（例如控制、增加或減少）可操作地連接之核苷酸序列藉由RNA聚合酶轉錄形成RNA分子。
組別1-4、8-11及15的血清Phe和Tyr含量隨時間推移而檢測（圖11A-11D）。 圖11E-11K顯示在表2所示的屍體剖檢時間點，小鼠肝臟中的載體基因體含量及mRNA含量。 投與1E+14 vg/kg劑量之動物子集在第2週時間點犧牲，以測量在肝臟中靶基因插入含量。 圖8A顯示全數據集，而圖8B顯示至12週具有減少的y軸刻度的數據，以允許更清晰地看到劑量含量之間的差異。
本文所揭示之rAAV基因體所使用的同源臂與靶基因座（例如在PAH基因中的靶基因座）側翼基因體實質上相同。 在某些實施例中，5’同源臂與靶基因座5’端之第一基因體區域具有至少約90%（例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%）之核苷酸序列一致性。 在某些實施例中，5’同源臂與第一基因體區域具有100%之核苷酸序列一致性。
爲了判定在PAH基因之基因座每一等位基因的靶插入含量，使用了利用微滴式數字PCR的測定法。 在該測定法中，靶插入藉由測量hPAH轉基因及基因體靶之間的遺傳連鎖來判定。 判定連接的至未連接的載體及基因體序列的數量可用於測量插入效率，其被報導為如每個等位基因之插入百分比。 使用PAHenu2小鼠模型通過測量載體基因體、靶基因插入百分比、hPAH mRNA表達及Phe/Tyr濃度用來對封裝於AAVHSC15衣殼之PAH校正載體建立劑量反應。