每個蛋白質點的強度係以膠體中蛋白質點總量進行標準化校正，以相對蛋白質點體積(%V)表示。 本發明所使用的「正常樣品」或「正常組織」，是代表無疾病或正常的細胞、組織、血液或血清，將患者樣品的測量值與其對照，以確定14-3-3β蛋白質含量是否少量，或者在患者樣品中的含量是否過量。 較佳地，正常樣品中關於14-3-3β蛋白質含量是與患者樣品中相應值，基本上相同的實驗條件下獲得。 腫瘤浸潤 正常樣品可以來自與患者樣品同種組織，或不同組織類型，獲得該正常樣品的健康個體可以選擇與患者具有相符合的特徵，例如年齡、性別、種族等。
以13200g離心30分鐘，以蛋白質檢測套組(購自Bio-Rad,Hercules,CA)測量其蛋白質濃度。 本發明所使用的「腫瘤浸潤」，是指惡性腫瘤細胞在質和量方面異常地分佈於組織間隙的現象，如腫瘤細胞粘連、酶降解、移動、基質內增殖等一系列過程的表現。 檢測一胃癌預後程度的方法 本發明係關於一種偵測預後程度的方法，特別是關於一種檢測一胃癌預後程度的方法。 蛋白質萃取及西方墨點法分析 組織樣品在取下後立即以液態氮冷凍保存。 本發明所使用的「分期」，係指依據胃癌之原始腫瘤大小，局部淋巴腺轉移的有無，以及遠處轉移的與否，分為0(原位癌)、I(又可分成IA、IB)、II、III(又可分成IIIA、IIIB)、IV五個等級。
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將結果整理如第6c、6d圖所示，可看出在以14-3-3β表現載體進行轉染之細胞在14-3-3β過度表現時，同時促進了胃癌細胞的侵入能力及轉移能力。 定義 發明所使用的「腫瘤標記」，係指與惡性腫瘤細胞相關之特殊蛋白質，由癌症細胞本身釋放到血液中或為癌症細胞誘發其他細胞釋放出的特殊蛋白質，在癌症發生時逐漸地在人體血液中升高。 14-3-3是一種酸性蛋白，大小約25-30kDa，主要存在於腦部和神經系統中，也在心、肝、腎、小腸和睾丸等組織中表達，也有少數存在於細胞膜、細胞核以及高爾基體、線粒體、葉綠體等細胞器中。 在哺乳類動物中具有至少七種亞型，分別是β、γ、ε、σ、ζ、τ、η，而其中β及γ的磷酸型則分別被命名為α、δ亞型。 14-3-3β的功能廣泛，包含代謝，細胞週期的控制，訊息傳導，細胞凋亡，蛋白運送，轉錄，壓力反應及惡性轉型等。 目前已知它和超過兩百種的受質結合，涵蓋細胞內幾乎所有的反應。
- 個體體內之14-3-3β表現量可在活體內或活體外測定，例如，14-3-3β量可在體外藉得自個體之生物樣本而測定，如投藥化合物前及後之腫瘤固體組織樣本、排泄物、血液或消化液。
- 在多個群組間比較時，係利用one-way ANOVA(SAS 9.1 software)。
- 參閱第5d~5e圖，其顯示出胃癌患者癌胚抗原含量與胃癌患者總體存活率及無復發存活率之關係。
- 故可從免疫組織染色實驗中再次確認腫瘤組織中14-3-3β表現量高於正常組織的結果。
- 而從胃癌的預後來看，也觀察到在手術後14-3-3β含量較高的胃癌患者，具有較差的預後情形，也就是具有較低的存活率。
參閱第2b~2d圖，係分別顯示正常組織(第2b圖)、腸道形腫瘤組織(第2c圖)及混合型腫瘤組織(第2d圖)之免疫組織染色結果(放大200倍)。 在腫瘤組織中，14-3-3β係在癌細胞之細胞核及細胞質中呈現陽性染色。 由第2b圖中可看到正常胃部組織中表現出微量的14-3-3β，第2c、2d圖中的腸道形腫瘤組織及混合型腫瘤組織之14-3-3β表現量明顯高於正常胃部組織。 故可從免疫組織染色實驗中再次確認腫瘤組織中14-3-3β表現量高於正常組織的結果。 組織及血液樣品 本發明所有人類組織樣品及血清樣品皆經由人體試驗委員會所核准。 本實施例中使用之40對腫瘤及正常組織的樣品皆是在手術後30分鐘取得後即保存於液態氮中。
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基本上，在本發明的測定中，將患者樣品中14-3-3β蛋白質含量與正常樣品中相應的值比較，該正常樣品預先製成表格並提供平均範圍、平均值和標準偏差，或類似表達方式。 實施例3 胃癌患者與正常人血液中14-3-3β的含量測定 血液樣品 本實施例所使用之血液樣品係經過病患之同意。 血液樣品係在手術前取自145位胃癌病患、63位控制組人員(38位男性及25位女性，平均年齡在46.2歲)，包括19位經內視鏡診斷為胃炎患者，19位非胃炎性消化不良者，及25位無胃部異常的自願者。 其中該145位胃位癌病患係在2001年7月至2006年3月間進行根治性胃切除術(其人口統計學結果參表2所示)。
本實施例中用以作為14-3-3β及癌胚抗原的質體量之診斷工具，利用敏感度對專一性(l-specificity)作圖以偵測不同分期之胃癌(第I~IV期)及正常人，並計算ROC曲線下的面積。 蛋白質萃取 為了進一步確認14-3-3β在抗癌藥物5-FU處理之實驗組胃癌細胞SC-M1細胞中，其表現量明顯受到抑制，萃取實驗組蛋白質樣品，以西方墨點法進行確認。 目前來說，胃癌診斷上有一些腫瘤標記陸續被發現，例如癌胚抗原、CA19-9、CA72-4(carbohydrate antigen 72-4)，但許多研究指出此些腫瘤標記對胃癌診斷上的敏感度及專一性都不高，往往造成診斷上的誤判及困難。 因此，具有高敏感度及專一性的生物標記，對於加強胃癌病患的早期偵測及診斷都具有極大的價值。 如申請範圍第1項所述之方法，其中檢測該血清樣品中 β含量是使用蛋白質分析方法，係為一西方墨點法。
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經由上述實施例所揭露之內容，可知14-3-3β的表現量在胃癌組織樣品比正常組織樣品更高，同時在血液樣品中也得到相似的結果。 在比較胃癌病人與正常人的14-3-3β表現量結果來看，可觀察到胃癌病人血液中14-3-3β含量比正常人更高，並且其14-3-3β含量增加的程度也隨著胃癌分期而增加。 而從胃癌的預後來看，也觀察到在手術後14-3-3β含量較高的胃癌患者，具有較差的預後情形，也就是具有較低的存活率。
- 將實驗組及控制組細胞樣品溶於含有7M的尿素、4M的CHAPS界面活性劑及2M的硫脲中，並以超音波震盪。
- 較佳分離的多肽或蛋白質是一種與其天然環境成分相比至少百分之九十五重量以上的相同的多肽或蛋白質構成，最佳是該分離的多肽或蛋白質為同質組合物，通過基於分子量和等電點的二維電泳常規分離，其能夠被分辨成單個的點。
- 在過去，約有80%罹患胃癌的病人常在診斷出胃癌時，已處於進行性胃癌的情況，且可能在手術後再度遭遇腫瘤復發的情況。
以ELISA讀取儀量測波長為570nm之光學密度值，並在各實驗組分別進行四次。 以MTT Assay測定細胞增殖作用 MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生、存活率以及細胞毒性的分析方法。 實施例2 比較胃腫瘤與正常組織之14-3-3β表現量差異 本實施例中所使用的胃組織係以40對腫瘤及正常組織作為對照。
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化合物治療胃癌的能力可在活體內藉投藥化合物至罹患胃癌之動物並測定此化合物對腫瘤大小，生長或轉移潛力之影響而確認。 本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係為利用14-3-3β蛋白質作為腫瘤標記以偵測胃癌的方法，其步驟包括：提供一生物樣品；檢測該生物樣品中14-3-3β含量；其中，該生物樣品中14-3-3β含量高於正常個體取得樣品之測定量，代表該胃癌之預後狀況不良。 在此主要根據TNM系統進行分期，進行切除的標準包括完整原生性胃腫瘤的切除，局部淋巴結切除的D2切除手術，且無巨觀腫瘤的存在，且該此些病患在手術時並未觀察到肝、肺及遠端器官之遠端轉移；未表現有其他先前的或共伴的腫瘤，而在手術進行前也未接受過化學治療或放射線治療。
通過常規的二維電泳分離對本發明所屬技術領域中通常知識者是習知的。 雖然，本發明已藉由參考前述較佳實施例而揭露，熟悉本發明技術領域者可輕易的據此做些許的改變或修飾，但此將不脫離本發明申請專利範圍所界定之範疇。 本發明所使用的「器官侵犯」，係當腫瘤直接侵入至少一個周邊結構例如十二指腸、食管、肝臟、結腸系膜或橫隔膜。
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數值變量的關聯性係利用MedCalc software version 9.0，並以p值表現其關聯係數。 參閱第5d~5e圖，其顯示出胃癌患者癌胚抗原含量與胃癌患者總體存活率及無復發存活率之關係。 相對而言，患者之癌胚抗原含量高於3ng/ml者，與其總體存活率及無復發存活率並無明顯之關連性。 顯示出14-3-3β比癌胚抗原更適於作為胃癌診斷之腫瘤標記。 從表1可發現該些蛋白質主要相關功能為抗細胞凋亡、細胞遷徙、信號傳遞、細胞骨架、細胞貼附及Ras蛋白信號傳遞，此些功能皆與腫瘤形成有關。 其中14-3-3β在抗癌藥物5-FU處理之實驗組胃癌細胞SC-M1細胞中，其表現量明顯受到抑制(參閱第1b、1c圖，14-3-3β為箭頭所指處，而右方為5-FU處理之實驗組，左方為其控制組)。
蛋白質點以二維電泳分離時，先進行等電點沉澱，以18cm膠條(pH 4-7)於20℃、8000V條件下，以IPGphor(購自Amersham Pharmacia Biotech)共進行91.2KVhr。 接著將膠條轉至12.5%無梯度SDS-PAGE進行二維分離。 所得影像利用ImageMaster software version 6.0(購自Amersham 腫瘤浸潤 Pharmacia Biotech)進行蛋白質偵測及定性。
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此些結果顯示出14-3-3β不但是一個與胃癌高度相關的蛋白質，同時也是一個可應用於胃癌早期偵測及預後的腫瘤標記。 同時，基於上述方法，發展出一種包含一有效量之14-3-3β抗體之檢測套組，可用於檢測胃癌有發展為腫瘤侵入或遠處轉移之危險性。 根據世界衛生組織估計，胃癌是全世界排名第四個最普遍被診斷的癌症，而且是所有癌症死亡率排名第二高，被視為國際間重要的健康危機。
臨床病理因素包括年齡、性別、腫瘤種類(Borrmann分類)、腫瘤組織學分類(Lauren分類)、腫瘤侵入深度、淋巴結轉移情形、血液侵入及腫瘤大小(腫瘤的長x寬)，參考其組織學發現並紀錄於病患資料庫。 結果參閱第4a~4e圖，其中第4a圖為第I期胃癌患者的14-3-3β(第4a圖)及CEA(第4a圖)之ROC曲線，第4a圖係顯示第I期胃癌病患14-3-3β之AUC值為0.75。 而當以血清中14-3-3β含量之決定最佳診斷的截斷點cut-off point為329ng/ml作為胃癌之早期偵測指標時，其敏感度為82%，而專一性為65%。 而四個不同時期的胃癌中，14-3-3β之AUC值皆高於癌胚抗原，顯示出14-3-3β測定胃癌比癌胚抗原更準確，更適於作為診斷指標。 本發明所使用的「癌胚抗原」是只存在胚胎時期的胚胎抗原，可溶於酸性的醣蛋白其醣質含量40%~60%，正常參考值為＜5.0ng/ml。
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根據目前研究，雖然已知14-3-3β與數種疾病如阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、巴金森氏症(Parkinson’s disease)有關，但與人類癌症較為相關的主要僅有14-3-3σ，與乳癌、胃癌等各種上皮癌症的發生有關。 一種對於胃腺癌個體預後之血清檢測套組，係包含一有效量之 β抗體，其中若血清中 β含量低於349 ng/ml，則代表該胃腺癌個體之五年總體存活率至少70%及五年無復發存活率至少60%。 將結果整理如第6e圖所示，可看出在當以14-3-3β表現載體進行細胞轉染時，胃癌細胞的增殖能力較佳，可推知14-3-3β的過度表現可促進胃癌細胞的增殖能力。 將細胞(5 x 104個)培養於24孔盤中24小時，並以14-3-3β表現載體及控制組空白載體(3μg)進行轉染24及48小時。 腫瘤浸潤 置於37℃下4小時之後，加入DMSO(500μl/well)以溶解所形成的甲臢沉澱物，靜置10分鐘。
胃癌的分類可分為早期胃癌及進行性胃癌，臨床表現症狀則是模糊且不具特異性。 在過去，約有80%罹患胃癌的病人常在診斷出胃癌時，已處於進行性胃癌的情況，且可能在手術後再度遭遇腫瘤復發的情況。 其中，血清學上的腫瘤標記則是一種簡便、節省成本的檢測方法，非常適用於早期無徵狀患者的胃癌檢測方面。 二維電泳(2-DE)及影像分析 為了比較在抗癌藥物5-FU處理後，胃癌細胞SC-M1內蛋白質表現量的差異，將5-FU處理過的實驗組胃癌細胞SC-M1細胞及未處理的控制組細胞，以二維電泳進行分析。 在進行二維電泳時，將500μg之實驗組與控制組蛋白質樣品加入65mM的二硫赤鮮醇以及0.5%(v/v)IPG緩衝液，於室溫下處理1小時，再以14000g離心30分鐘。